Úsek pro vědu a výzkum

Terapeutické Hemafrézy

Aferetické oddělení ÚHKT  - terapeutické a buněčné produkční hemaferézy (aferézy)

Výkony se provádějí za pomoci techniky hemaferézy na separátorech krevních složek, které obvykle využívají centrifugační princip.

  • Terapeutické hemaferézy Cíle terapie spočívají v snížení obsahu zmnožených krevních nebo patogeneticky aktivních komponent v cirkulaci nemocného.
  • Produkční aferézy se sběrem buněk pro transplantaci a hemopoetickou rekonstituci

Separace krvetvorných buněk z periferní krve od mobilizovaných dárců a pacientů k plánované alogenní a autologní transplantaci. Výkony se provádějí v standardním nebo ve velkoobjemovém režimu při zpracování více než tří objemů krve dárce nebo pacienta. Separace alogenních mononukleárních buněk adoptivní imunoterapii (DLI) od nemobilizovaných dárců. Na pracovišti se dlouhodobě sleduje bezpečnost dárců po mobilizaci a separaci buněk.

  • Separace autologních mononukleárních buněk pro individualizovanou protinádorovou terapii, např. pro přípravu CAR-T lymfocytů.
  • Bezpečnost terapeutických a produkčních buněčných hemaferéz

 

Terapeutické hemaferézy

  1. Depleční leukocytaferéza (odběr bílých krvinek, separace/deplece leukocytů)

Léčebný výkon sloužící k rychlému snížení obsahu zmnožených bílých krvinek v oběhu nemocného. Na separátoru se bílé krvinky oddělují od ostatních složek krve a odebírají se do sběrného vaku. Výkon se provádí u hyperleukocytárních nemocných s akutní nebo chronickou leukémií. se nejčastěji indikuje u nemocných s akutní nebo chronickou myeloidní leukémií, kteří mají počet leukocytů vyšší než 100×109/l, u nichž dochází k projevům leukostázy a hyperviskozity krve.

  1. Depleční trombocytaferéza se provádí u nemocných s vyšším počtem trombocytů než 1000×109/l, např. u chronické myeloidní leukémie (CML) a dalších myeloproliferativních onemocnění (esenciální trombocytémie, primární polycytémie a myelofibrózy).
  1. Depleční erytrocytaferéza umožňuje snížení zmnoženého obsahu erytrocytů u primární polycytémie. Též představuje účinný postup při odstranění nadbytku železa v organismu u stavů s chronickým přetížením železem, např. u hemochromatózy a sekundární hemosiderózy. Výkon je vhodný v situacích, kdy je třeba rychle odebrat z cirkulace nemocného větší obsah erytrocytů. Erytrocytaferéza je účinnější než terapeutická venepunkce a nedochází při ní k ztrátám plazmatických proteinů, trombocytů a granulocytů.
  1. Výměnná erytrocytaferéza (výměna červených krvinek, výměna erytrocytů)

Léčebný výkon sloužící k rychlému odstranění abnormálních červených krvinek z oběhu nemocného a k jejich náhradě červenými krvinkami od zdravých dárců. Využívá se např. v léčbě srpkovité anémie. při níž lze u pacientů se srpkovitou anemií nebo malárií odstranit z oběhu větší množství patologických erytrocytů, které se nahrazují erytrocyty od zdravých dárců.

  1. Výměnná (terapeutická) plazmaferéza

V průběhu výkonu dochází k účinnému odstranění velkého objemu plazmy z krevního oběhu pacienta a k její náhradě plazmou, přípravkem Octaplas (směsná plazma ošetřená inaktivací patogenů, filtrovaná), roztokem albuminu, případně kombinací krystaloidních a koloidních roztoků. S plazmou se odstraňují autoimunitní protilátky (IgM nebo IgG), aloprotilátky, cirkulující imunokomplexy, paraproteiny (hyperviskózní syndrom, kryoglobulinemie), inhibitory koagulačních faktorů (f. VIII), enzymů (TTP- trombotická trombocytopenická purpura).

  1. Extrakorporální imunoadsorpce

V současné době se vyvíjejí stále účinnější separační techniky, při nichž se k redukci obsahu patogenních složek v cirkulaci používají více selektivní postupy jako u extrakorporální imunoadsorpce. Tyto techniky využívají chemické, fyzikální nebo imunologické principy. Nejprve se za pomoci techniky hemaferézy (centrifugací nebo filtrací) separuje z cirkulace pacienta plazma. Plazma následně prochází imunoadsorpční kolonou, v níž dochází k adsorpci patogenní komponenty – obvykle IgG nebo LDL, která poté zůstává vázaná na koloně, zatímco ošetřená plazma se vrací zpět do oběhu nemocného. Těmito postupy lze odstranit z cirkulace cca 80-90% látek s menší molekulou. Na rozdíl od výměnné plazmaferézy je tato technika účinnější a navíc není zapotřebí provádět substituci odebrané plazmy náhradními roztoky nebo plazmou od zdravých dárců. Indikuje se v terapii nemocných s autoimunitními onemocněními refrakterními na standardní léčbu nebo u těžkých familiárních poruch metabolizmu lipidů. Je jedinou možností léčby hypercholesterolémie u pacientů, kteří neodpovídají na dietní, režimovou a farmakologickou léčbu. Separace IgG má velký význam v redukci hladin autoimunitních protilátek proti acetylcholinovému receptoru typu IgG u myasthenia gravis nebo proti faktoru VIII u hemofilie A.

  1. Extrakorporální fotochemoterapie (ECP, fotoferéza) Léčebný postup, který ovlivňuje reaktivitu imunitního systému, ale nevyvolává generalizovanou imunosupresi. ECP se indikuje v terapii onemocnění, na jejich patogenezi se podílejí T lymfocyty, jako je reakce štěpu proti hostiteli (GVHD) a terapie kožních T lymfomů.

Nejprve se technikou leukocytaferézy odeberou z krve nemocného mononukleární buňky (lymfocyty a monocyty, dále MNC). MNC se poté fotomodifikují pomocí fotosenzibilující látky 8-metoxypsoralenu a ultrafialového záření A. Upravené buňky se vracejí jako autotransfuze nemocnému.

  1. Extrakorporální hemorheoferéza je účinná forma mimotělní membránové diferenciální filtrace plazmy, která umožňuje eliminaci látek s vysokou molekulovou hmotností, např.  fibrinogenu, a 2-makroglobulinu, imunoglobulinu M (IgM), trombomodulinu a LDL lipoproteinů. Technika je účinným terapeutickým postupem v léčbě pacientů s poruchami mikrocirkulace, k nímž patří také věkem podmíněná makulární degenerace (VPMD).

Výkon se provádí za pomoci techniky dvojité filtrace – krve a plazmy. Nejprve se z plné krve pacienta oddělí plazma, která následně prochází druhým filtrem, na kterém se odstraní látky s vysokou molekulovou hmotností. Ze sledovaných biochemických ukazatelů dochází dle našich výsledků k poklesu v hladině alfa2-makroglobulinu (69%), IgM (67%), LDL cholesterolu (58%) a fibrinogenu (54%). Obsah látek s nízkou molekulární hmotností v séru se výrazně nemění (minerály, celkový protein a albumin, glukóza).

  • Produkční aferézy se sběrem buněk pro transplantaci a hemopoetickou rekonstituci
  1. Separace krvetvorných buněk z periferní krve (PBPC, PBSC – Peripheral Blood Progenitor Cells, Peripheral Blood Stem Cells)

Výkony se provádějí jak u zdravých dárců (PBPC pro alogenní transplantaci), tak i u nemocných (PBPC pro autologní transplantaci). PBPC exprimují na svém povrchu glykoprotein CD34, který lze detekovat pomocí metody průtokové cytometrie. Před sběrem PBPC je u dárců a pacientů nutná mobilizace hematopoetických prekurzorů z kostní dřeně do periferní krve. Autologní PBPC se připravují pro terapii pacientů s hematologickými maligními onemocněními nebo s autoimunitními onemocněními. Alogenní PBPC se připravují pro terapii pacientů s hematologickými maligními onemocněními, se selháním funkce kostní dřeně, s imunodeficitními syndromy a s vrozenými metabolickými poruchami. U nemocných po vysokodávkované nebo myeloablativní chemoterapii jsou PBPC schopné zajistit obnovu hemopoetických a imunitních funkcí.

Za běžných podmínek se nachází v krvi jen velmi malé množství krvetvorných buněk. Toto množství buněk by nestačilo obnovit krvetvorné a imunitní funkce nemocného. Proto se před sběrem PBPC u dárců a u nemocných provádí mobilizace krvetvorných buněk z kostní dřeně do periferní krve. Pacientům v mobilizační přípravě se obvykle podává kombinace chemoterapie a růstových faktorů. Dárci se mobilizují pouze pomocí růstových faktorů. Chemoterapie se dárcům nepodává.

Někdy se mobilizace nezdaří, z kostní dřeně se vyplaví jen malé množství krvetvorných buněk a separační technikou nelze získat jejich potřebnou dávku. Uvádí se, že cca u 5 % zdravých dárců dochází k selhání mobilizace krvetvorných buněk z kostní dřeně do krve. U nemocných, u nichž je účinnost mobilizace navíc ovlivněna základním onemocněním a rozsahem předchozí chemoterapie / aktinoterapie, dochází k selhání mobilizace častěji až v 30 % případů.

Doba přihojení krvetvorných buněk po transplantaci se definuje jako vzestup počtu neutrofilních leukocytů nad hodnotu 0,5×109/l nebo trombocytů nad 20, resp. 50×109/l. K přihojení  dochází obvykle mezi 12. až 14. dnem po převodu. Tato doba je významně kratší ve srovnání s dobou při hojení krvetvorných buněk z kostní dřeně, k níž dochází v intervalu 20 – 30 dnů.

Separace krvetvorných buněk z periferní krve

Separace PBPC se provádějí

  1. ve standardním režimu, při němž se zpracovávají 2 – 3 celkové objemy krve nemocného nebo
  2. ve velkoobjemovém režimu, kdy se zpracovávají více než 3 objemy krve nemocného.

Výkony se liší nejen rozsahem, ale i antikoagulačními postupy a průtokovými rychlostmi. Velkoobjemové výkony umožňují získat vyšší dávky CD34+ buněk než standardní výkony jak u dárců tak u pacientů. U dobře mobilizovaných pacientů a dárců lze pomocí jednoho až dvou výkonů připravit potřebné množství CD34+ buněk pro transplantaci. Doba jednoho výkonu se pohybuje od 3 do 5 hodin.

Standardní a velkoobjemové separace patří k technicky náročnějším hemaferetickým postupům. V jejich průběhu se zpracovávají velké objemy krve a podávají se vyšší dávky antikoagulačních roztoků než u ostatních výkonů. Antikoagulační přípravky působí buď převážně v extrakorporálním okruhu (ACD-A) nebo se do separačního okruhu ještě přidávají látky se systémovým účinkem (heparin). V průběhu výkonů může dojít k významnému poklesu parametrů krevního obrazu, hladin minerálů v plazmě a k ovlivnění výsledků koagulace.

  1. Alogenní přípravky pro adoptivní imunoterapii – pro infuzi mononukleárních buněk

k vyvolání Graft vs. Leukemia efektu. Do této skupiny patří příprava koncentrátů mononukleárních buněk – lymfocytů a monocytů (MNC) pro DLI (Donor Lymfocyte Infusion).

Mononukleární buňky se separují od zdravého dárce, který v předchozím období daroval nemocnému krvetvorné buňky (PBPC) pro alogenní transplantaci. V případě, že se u pacienta po transplantaci vyvíjí relaps základního onemocnění, daruje stejný dárce mononukleární buňky, které jsou schopné indukovat reakci štěpu proti leukemii a potlačit relaps onemocnění (GVL, Graft versus Leukemia).

U dárců MNC se již před vlastním sběrem neprovádí mobilizace buněk. V průběhu výkonu se zpracová jeden až dvojnásobek krevního objemu dárce. Cílem je příprava koncentrátu s obsahem CD3+ T-lymfocytů obvykle v rozmezí 1×107 až 5×108/kg hmotnosti příjemce. Volba dávky závisí na základním onemocnění a stavu pacienta.

Žádanka na výkon zde (aktivní odkaz do sekce žádanek)

  • Separace autologních mononukleárních buněk pro individualizovanou protinádorovou terapii
  1. Autologní mononukleární buňky pro přípravu CAR-T lymfocytů

Nejprve se za pomoci techniky leukocytaferézy provádí autologní separace nemobilizovaných mononukleárních buněk (lymfocytů a monocytů, MNC), které slouží k přípravě CAR-T lymfocytů. Postup představuje účinnou terapii u pacientů s CD 19 relabujícími nebo refrakterními Non-hodgkinskými lymfomy - DLBCL, MCL, FL. Může být účinný u B-ALL nebo MM (mnohočetného myelomu). Po separaci se  MNC buňky transportují do laboratoří zpracovatele, kde se provádí jejich genetická modifikace, obvykle za pomoci lentivirového vektoru. Do buněk se vpraví genetický kód pro anti CD 19 chimérický antigenní receptor specifický pro rozpoznání CD 19 antigenu nádorových buněk. CAR T lymfocyty jsou po podání nemocnému schopné specificky rozpoznat a navázat antigen na povrchu nádorových buněk a aktivovat T lymfocyty za vyvolání cytotoxického efektu. V posledních letech se sleduje také účinnost terapie za pomoci CAR-T lymfocytů u některých autoimunitních onemocnění, např. SLE (systémový lupus erytematodes a jiné).

Žádanka na výkon zde (aktivní odkaz do sekce žádanek)

  1. Bezpečnost terapeutických hemaferéz

Přestože se terapeutické hemaferézy považují za bezpečné výkony, mohou v jejich průběhu nastat nežádoucí reakce. Během separací dochází k přesunům tekutin mezi intravaskulárním a extravaskulárním prostorem, ke změnám v hladinách minerálů v plazmě, ke změnám hladin koagulačních  faktorů a imunoglobulinů.

Ve zvýšeném riziku nežádoucích reakcí se nacházejí pacienti:

  • s poruchami kardiorespiračního systému s nestabilními vitálními funkcemi,
  • v intenzivní péči,
  • s anémií a s trombocytopenií,
  • s krvácivými komplikacemi,
  • léčení ACE inhibitory,
  • s alergií,
  • s potransfuzními reakcemi v anamnéze,
  • gravidní pacientky.

Pacienti mohou být v bezvědomí (např. u TTP), na terapii kyslíkem nebo na ventilační podpoře. Mohou mít známky orgánového selhávání. V takových situacích je nutné zajistit pokračování podpory vitálních funkcí a další intenzivní péči i v průběhu výkonu.

Během náročnějších výkonů, např. u velkoobjemových separací PBPC, mohou nastat významné změny v hladinách minerálů v séru (pokles hladin K+, Mg++, Ca++) a také může dojít k výraznému ovlivnění parametrů koagulace a krevního obrazu. Hypokalemie pacienta může být nebezpečná i při mírném poklesu hladiny kalia v plazmě, zvláště je-li pacient současně léčen přípravky, které myokard senzibilizují, např. digoxinem. Alkalóza potencuje vliv hypokalemie a obdobně působí podání glukózy a inzulinu.

V průběhu výměnných terapeutických výkonů se pacientům podávají transfuze, které mohou být provázené potransfuzními reakcemi. Při výměnné plazmaferéze v terapii TTP a HUS se opakovaně transfundují velké objemy plazmy (plazma z plné krve, plazma z aferézy,  kryosupernatantní plazma nebo solvent detergentní plazma - Octaplas). Přípravky erytrocytů se podávají ve velkém množství a opakovaně při provádění výměnné erytrocytaferézy u pacientů s malárií nebo se srpkovitou anémií. Erytrocyty se též používají k předplnění přístroje při provádění terapeutické hemaferézy u dětí. Je vhodné, aby přípravky erytrocytů nebyly starší 7 dnů.

U plánovaných výkonů je vhodné předem zajistit dostatečnou přípravu pacienta – ověřit, ev. připravit vyhovující žilní přístup, zajistit minimální hodnoty krevního obrazu (hematokrit minimálně 21 % – vhodněji alespoň 24 %, trombocyty vyšší než 50×109/l), ověřit stav kardiorespiračního systému, renálních a hepatálních funkcí, mineralogram a parametry koagulačních vyšetření – aPTT a Quick, hladina fibrinogenu. Není vhodné, aby byl pacient v průběhu výkonů na souběžné terapii ACE inhibitory pro zvýšené riziko závažných hypotenzivně – anafylaktoidních reakcí (aktivace kalikrein – kininového systému a produkce bradykininu). V průběhu výkonů je vhodné monitorování vitálních funkcí, zvláště u klinicky nestabilních nemocných. V průběhu výkonu jsou dárci i pacienti pod stálým dohledem sestry a lékaře.

Nežádoucí reakce se obvykle vyskytují v rozmezí  3 – 25  % výkonů. Většina komplikací souvisí s nedostatečnou funkcí žilního přístupu nebo s klinicky nestabilním stavem pacienta. Vlastní separační proces vyvolává nežádoucí reakce v menším počtu případů, cca v 1 – 11 % výkonů. Reakce jsou většinou méně závažné a lze je úspěšně vyřešit i bez předčasného ukončení výkonu, např. hypokalcemie nebo lehčí hypotenzní reakce pacienta. Nicméně byly velmi vzácně popsány i závažné komplikace – v důsledku krvácení, kardiopulmonálního selhání, syndromu TRALI nebo v souvislosti se vznikem těžké hypotenzivně-anafylaktoidní reakce u nemocných léčených ACE inhibitory.