Vyšetření mutací v genu HBB a klonality (neakreditovaná vyšetření)

SOP 06: Stanovení klonality pomocí STR polymorfismu v genu HUMARA fragmentační analýzou

Představa klonality nádorových onemocnění je všeobecně přijímaná, a proto může být průkaz klonality markerem detekujícím nádorové onemocnění. Při vyšetření klonality se předpokládá, že dochází-li ke klonální expanzi, děje se to na úrovni jedné jediné buňky, která je zakladatelem klonu. Mluvíme-li o klonálním (monoklonálním) výsledku, znamená to, že populace buněk, kterou jsme vyšetřili, vznikla z jedné buňky. Výsledek polyklonální, svědčí o normální populaci buněk. Určení klonality lze použít jak pro vyšetření solidních tumorů, tak pro hematologické malignity.

Uvedené vyšetření lze provádět pouze u žen, protože při určování klonality se vychází z poznatku, že ženské buňky mají pouze jeden aktivní X chromozóm. Druhý X chromozóm je inaktivován v časné embryogenezi a zůstává inaktivován ve všech následujících somatických generacích. Inaktivace se uskutečňuje v časném stádiu blastogeneze, asi kolem 12 dne embryogeneze a je to děj náhodný (v některých buňkách se inaktivuje chromozóm mateřského, v jiných otcovského původu) a zůstává fixován na stejný chromozóm ve všech následných generacích buněk dané buněčné linie. Každá ženská buňka přepisuje pouze jeden X chromozóm, buď mateřský, nebo otcovský. Normální, zdravý ženský organismus tedy představuje mozaiku dvou druhů buněk s odlišnými aktivními X chromozómy, zatímco monoklonální ženská tkáň je tvořena buňkami nesoucími tentýž aktivní chromozóm.

Při vyšetření klonality se musí odlišit aktivní X chromozóm od inaktivního a X chromozóm mateřského původu od otcovského původu. K rozlišení mateřského od otcovského se používá - polymorfismus STR (Short Tandem Repeats) androgen receptorového genu (HUMARA), což je variabilita v počtu opakujících se CAG tripletů (17-30x). Více jak 90% žen je v tomto lokusu polymorfních. K odlišení aktivace se využívá rozdílná methylace, kdy se pracuje s methyl-senzitivními enzymy (např. HpaII, HhaI). Tyto enzymy jsou schopny rozštěpit jen nemethylované úseky DNA, což znamená, že se rozštěpí jen aktivní části chromozomů a dále se pracuje pouze s DNA molekulami z inaktivních X chromozomů.

Technická vedoucí: Mgr. Monika Beličková