TEST KITU PRO DETEKCI HPV – Amplifisens HPV HCR Screen

Test je určen pro detekci HPV DNA ve vzorcích stěrů děložního krčku a pochvy, popř. mužské uretry. Výrobce dodává i kit DNA-Sorb-A-variant100 určený k izolaci DNA a transportní médium s negativní kontrolou izolace. Test je schopen detekovat HPV typy fylogenetických skupin A7, A6 a A9, které jsou tvořeny typy 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 53, 56, 58, 59, 66 a 70. Detekce HPV je založena na amplifikaci daných HPV typů pomocí PCR a následné vizualizaci PCR produktů na elektroforéze. Velikost PCR produktů HPV se pohybuje od 267 pb do 325 pb. Současně s typem HPV je amplifikován kontrolní úsek β-globinového genu o velikosti 723 pb pro kontrolu amplifikace a integrity testované DNA.

Provedení:

Pomocí izolačního kitu DNA-Sorb-A-variant100 jsme izolovali DNA z 6 cervikálních stěrů odebraných do 200 µl STM média od pacientek s patologickým nálezem na děložním hrdle. Vzorek s STM byl nejprve stočen 30min při 14 000 otáčkách, STM bylo odebráno a bylo přidáno 200 µl transportního média. Z takto připraveného vzorku byla polovina použita pro izolaci DNA.
Kit je založen na lýze buněk, navázaní DNA na partikule, promytí DNA a eluci DNA pomocí TE pufru. Pro detekci HPV DNA byly použity jednak tyto vzorky izolované pomocí firemního izolačního kitu, dále ředící řada buněčné linie SiHa, která je odvozena z karcinomu děložního čípku a obsahuje jednu kopii genomu HPV 16 na buňku, ředění HPV klonů 18 a 53, a vzorky DNA z banky vzorků NRL pro papillomaviry izolované pomocí kitu Qiagen midi kit (Qiagen, Crawley,UK), které byly charakterizované z hlediska typu HPV několika dalšími metodami. Jako negativní kontrola byla použita sterilní H2O. Dalšími kontrolami byly kontroly z kitu: lidská DNA a lidská DNA s HPV DNA. Vzorky izolované pomocí izolačního kitu DNA-Sorb-A-variant100 byly amplifikovány dvakrát, stejně tak jako kontroly reakce pro zjištění reprodukovatelnosti testu. PCR reagencie byly smíchány s DNA polymerázou, rozplněny a do každé mikrozkumavky byla přidána DNA, popř. H2O. PCR reakce byla provedena na cykleru MJ Research 200. PCR a produkty jsme vyhodnotili pomocí elektroforézy, gel byl připraven podle firemního protokolu.

Hodnocení NRL:

Příbalový leták:

Příbalový leták je napsán vyhovujícím způsobem. Poznámky k doplnění některých údajů jsou uvedené dále.

Odběr a izolace:

Izolace pomocí mikrokuliček byla jednoduchá, rychlá. Pouze při lýzi buněk při 65°C došlo k vysrážení jakési „sole“ v okolí zkumavek na termobloku a sušení „sorbentu“ (partikulí) bylo nutné prodloužit na 15 min, neboť většina vzorků nebyla po 10 min suchá.

Amplifikace a elektroforéza:

S amplifikační částí kitu se pracovalo dobře. Ingrediencí pro PCR je v setu dostatek. V příbalovém letáku je uvedena nutnost použití oleje pro převrstvení amplifikační směsi. Bylo by však vhodné uvést, že alternativou je použití termocykleru s vyhřívaným víkem. K vizualizaci produktu na elektroforéze máme jen poznámku, že práce s EtBr, který je zde přidán přímo do gelu, není z hlediska bezpečnosti práce nejvhodnější volbou pro rutinní provoz. Mimo to, jako malou poznámku v EtBr, jsme našli sraženinu, která se rozpustila až po velmi dlouhé době (cca 2 týdny). S výsledkem detekce neinterferovala, ale bylo by třeba na toto upozornit v návodu na použití setu.

Citlivost testu a reprodukovatelnost:

Citlivost setu byla 10 kopií HPV 16 na reakci, což je vyšší než deklaruje výrobce. Pro HPV klony 53 a 18 byla citlivost až 1pg DNA na reakci. HPV klony však neukazují reálnou amplifikaci HPV typu ve vzorku, neboť se jedná o čistou DNA. U klinických vzorků nebyl identifikován typ HPV 70 u dvou vzorků, jednou HPV 18 a velmi slabou reakci jsme detekovali u vzorku pozitivního na HPV 53. Vzhledem k citlivosti setu při použití klonů se nedá vyloučit horší funkce setu v případě přítomnosti variant typů. U několika vzorků s vysokou koncentrací viru, či s více HPV typy ve vzorku nedošlo k amplifikaci interní kontroly – beta-globinového genu, což není chybou, ale měla by být tato možnost zmíněná v návodu k použití setu.
Reprodukovatelnost testu je dobrá, opakované vzorky vyšly v obou reakcích shodně. Test byl však provedený pouze za použití stejného kitu. Neměli jsme k dispozici 2 kity odlišného výrobního čísla.

Závěr:

Při testování setu v Amplifisens HPV HCR Screen v naší laboratoři jsme ověřili charakteristiky testu tak jak deklaruje výrobce: jednak co do spektra typů, které set detekuje a dále co do citlivosti. Provedení testu je jednoduché, takže z tohoto pohledu použitelné pro rutinní provozy zavedené na molekulárně biologické testy (především pro PCR, nutnost oddělených prostor). Pouze použití EtBr je poněkud nevhodné pro rutinní provoz. Test též prokázal dobrou reprodukovatelnost při opakovaném použití setu s tímtéž výrobním číslem. Vzhledem však k absenci rozsáhlejších klinických studií využívajících tento set k  HPV DNA detekci a k absenci studií srovnávajících tento set s jinými sety běžně používanými, nemáme v této chvíli dostatečné podklady proto, abychom tento set mohli doporučit pro rutinní využití.

Autor: RNDr. Ruth Tachezy, Ph.D.
Datum: 31. října 2007

• Tabulka 1: Výsledky detekce pomocí Amplifisens HPV HCR Screen setu [GIF]