TEST KITU PRO DETEKCI HPV: NucliSENS EasyQ® HPV

Test NucliSENS EasyQ amplifikuje a detekuje nukleové kyseliny v reálném čase, test je určen ke kvalitativnímu stanovení E6/E7 mRNA pěti typů lidských papillomavirů (HPV) - HPV 16, 18, 31, 33 a 45 ve stěrech hrdla děložního. Automatický systém kombinuje amplifikaci NASBA a detekci pomocí specifické próby s flouroforem a zhášecí komponentou. Kontrolní reakci představuje amplifikace U1A mRNA, která je přítomná ve všech lidských buňkách. Amplifikace NASBA využívá specifických primerů k nasednutí na RNA, AMV- reverzní polymerázu k tvorbě duplexu RNA-DNA, poté je degradována RNA v duplexu pomocí RNázy H a následuje zpětná transkripce pomocí T7 RNA polymerázy pro opětovný přepis do RNA, která může sloužit pro další proces amplifikace. Tyto kroky se neustále opakují. Amplikony jsou v reálném čase rozpoznávány specifickou probou a množství vyzářené fluorescence je měřeno flourometrem NucliSENS EasyQ Analysator. 

Odběrovým médiem doporučeným výrobcem je PreservCyt. Pro stabilitu RNA je doporučeno skladování max. 24 hod při teplotě 2°C až 30°C, max. 2 měsíce při teplotě -70°C. Pro izolaci nukleových kyselin jsou předepsány magnetické extrakce NucliSENS EasyQ® miniMAGTM pro manuální izolaci a NucliSENS EasyQ® easyMAGTM pro automatickou extrakci. K amplifikaci a detekci je kit NucliSENS EasyQ® HPV verze 1.0 (NSE) určený pro souběžné testování 8, 18 nebo 30 vzorků, důležitou součástí testu je NucliSENS EasyQ Analysator, NucliSENS EasyQ Analysis Software a NucliSENS EasyQ Incubator. Software NucliSENS EasyQ Director umožňuje automatický odečet výsledků na základě fluorescenčních křivek.

Provedení:

Do této studie bylo zařazeno 102 pacientek se suspektním a/nebo patologickým nálezem na děložním hrdle. Stěr z hrdla děložního byl odebrán do média PreservCyt a skladován podle pokynů výrobce. Izolace nukleových kyselin byla, po dohodě s výrobcem, provedena kitem RNAeasy mini firmy Qiagen z odebraných 10ml, stejně jako při izolaci pomocí NucliSENS EasyQ setu. Izolované nukleové kyseliny byly před provedením testu skladovány při -70°C. Současně byla z media PreservCyt odebrána část materiálu pro detekci high-risk (HR) HPV typů testem Hybrid Capture 2 (HC2) a dle firemního protokolu firmy Digene byla provedena konverze vzorků Conversion kitem firmy Digene. Jako negativní kontrola byla použita sterilní H2O. Pozitivní kontrola byla součástí testu. Testované vzorky jsme analyzovali v sériích: třikrát po 8 vzorcích, 1x po 16 vzorcích a 2x po 30 vzorcích, 1 vzorek byl opakován. U diskrepantních vzorků byla přítomnost viru ověřena další metodou a případně byl určen typ HPV (Tabulka 1).

Hodnocení NRL:

Ze 102 vzorků 5 bylo nehodnotitelných jednou z použitých metod a proto byly vyřazené z konečné analýzy. Z 97 zbývajících materiálů 34 vzorků vykazovalo diskrepantní výsledky ve dvou použitých testech. Tři vzorky byly negativní na HC2, ale pozitivní pomocí NSE (typy HPV 18, HPV 45 a HPV 33). Zde předpokládáme diskrepanci v důsledku vyšší citlivosti NSE setu a nízké virové nálože ve vzorcích. Negativita výsledku HC2 bude ještě ověřena další metodou. Dalších 31 vzorků bylo pozitivních v HC2 reakci a negativních metodou NCE. Zde by se výsledek mohl interpretovat jako pravděpodobná regrese onemocnění. Otázkou však zůstává interpretace vzorků, které obsahují HPV typy řazené mezi lidské kancerogeny (skupina HR HPV) a které není NSE set schopen detekovat. Jejich výskyt v populaci je obvykle výrazně nižší než výskyt typů, které detekuje NCE, ale riziko vzniku a progrese s nimi spjaté se může například měnit dle věku ženy, dle délky perzistence. Právě proto je třeba u těchto žen pokračovat v dlouhodobém sledování. U těchto vzorků jsme dokončili určení typu zatím pouze u 12/31 selektovaných vzorků. Z těchto 12 vzorků ve čtyřech byl přítomný typ HR HPV, který detekuji i NSE a můžeme tedy nález interpretovat jako pravděpodobnou regresi. U zbývajících 8 vzorků byly nalezené jiné typy HR HPV. Ženy v obou testech negativní (N=22) mají, s největší pravděpodobností nulové riziko vzniku a progrese onemocnění. Nejvyšší riziko se dá předpokládat u žen, které jsou v obou testech pozitivní. V této skupině se jednalo o 41 subjektů (Tabulka 1). Všechny ženy zařazené do studie byly též vyšetřené kolposkopicky a cytologicky. Cytologická diagnóza u většiny žen bude doplněna. Na základě kolposkopické diagnózy je patrné, že lékař zařadil do studie především ženy z atypickou transformační zónou a s předešlým suspektním nálezem v anamnéze (70% souboru), dále ženy s nálezem low-grade lezí (LGL) (14% souboru). Pouze 7% souboru tvořily ženy s normálním kolposkopickým nálezem. Po provedení hodnocení rizika vzniku a/nebo progrese onemocnění na základě výsledků dvou použitých testů 44% žen s ATZ a 71% žen s LGL se začlenilo do skupiny žen s vysokým rizikem progrese, 35% a 7% do skupiny žen s pravděpodobnou regresí onemocnění a 19% a 14% do skupiny s nulovým rizikem. V této skupině bylo i 71% žen (5/7) s normálním nálezem (Tabulka 2). Další hodnocení provedeme až po doplnění výsledků cytologie a výsledků kontrolního vyšetření v odstupu jednoho roku.

Příbalový leták:

Příbalový leták je velmi dobrý, pouze část týkající se práce s programem pro měření vzorků je nejasná.

Odběr a izolace:

Jak jsme experimentálně ověřili, je možné využít k izolaci mRNA kit RNAeasy mini firmy Qiagen. V 10 ml odběrového média je ve většině případech dostatečné množství nukleové kyseliny pro detekci HPV.

Amplifikace a hybridizace:

S amplifikační částí kitu se pracovalo dobře. Množství všech reagencií je dostatečné i při opakovaném použití při vyšetřování menších sérií vzorků. Různé barevné označení zkumavek pro tři různé amplifikační směsi ulehčuje manipulaci a orientaci. Je však nutná velká opatrnost a soustředění při pipetování 3x 30-ti vzorků a třech různých amplifikačních směsí do stripů na destičce.

Analýza výsledků:

Práce se softwarem je velmi složitá, program není uživatelsky příjemný. Nevýhodou je také, že export výsledků do programu excel je možný jen v podobě textu a není tedy možné následně data upravovat.

Závěr:

Dle praktických zkušeností lze tento set doporučit pro pracoviště s vybavením pro molekulární biologii (prostory) a s personálem se zkušeností v provádění metod založených na PCR. Pro použití pro rutinní účely by bylo potřebné vylepšit program pro měření vzorků a následné zpracování dat v běžně dostupných databázových programech (excel). Hodnocení testu z hlediska citlivosti, specifiky, PPV a NPV lze provést až po doplnění údajů po ročním sledování. Kompletní vyjádření k diskrepantním vzorkům lze provést až po dokončení vyšetření všech materiálů dalšími metodami. Tato zpráva je pouze předběžná.

Přílohy:

Tabulka 1: Kolposkopická a cytologická diagnóza pacientek a výsledky dvou testů vyšetření na HPV a dále výsledky testů určení typu HPV a interpretace nálezů. Obrázek [GIF]

Tabulka 2: Kolposkopické nálezy u skupin pacientek rozdělených dle rizika progrese či regrese onemocnění stanoveného na základě výsledků dvou testů pro HPV detekci a dle kolposkopického nálezu.

Progrese= HC2 pozitivní, NSE pozitivní 
Pravděpodobná progrese= HC2 negativní, NSE pozitivní 
Pravděpodobná regrese= HC2 pozitivní, NSE negativní 
Žádné riziko= HC2 i NSE negativní 

Autor: RNDr. Ruth Tachezy, Ph.D.

Datum: 15. srpna 2008